Variasi pH untuk Meningkatkan Performa Pemisahan pada Kolom Fase Terbalik (Reversed Phase)

Variasi pH untuk Meningkatkan Performa Pemisahan pada Kolom Fase Terbalik (Reversed Phase) 

Variasi pH  

Biasanya pH tidak dianggap sebagai sesuatu yang dapat digunakan untuk meningkatkan resolusi dengan penambahan senyawa asam atau basa pada kromatografi fase terbalik karena pada dasarnya silika rentan rusak pada pH > 8. Akan tetapi, jika C18 berikatan dengan gugus silanol yang berbeda pada permukaan silika maupun dengan kelompok C18 lain maka akan membentuk crosslinked, modifikasi polimer inilah yang membuat kolom jauh lebih tahan terhadap pH ekstrim.

Waktu retensi senyawa asam atau basa dapat diubah dengan menyesuaikan nilai pH fase gerak (mobile phase) berdasarkan sampel yang akan kita analisa (senyawa yang bermuatan atau netral). Biasanya, didapatkan hasil yang baik dengan pengaturan pH 1,5 diatas atau dibawah nilai pKa senyawa yang akan dianalisa.

Hasil

Pada pH di bawah pH 8,0, amitriptyline dielusi dengan volume void (1,4 menit). Eksperimen terpisah (tidak ditampilkan) menggambarkan bahwa konsentrasi asetonitril (MeCN) harus turun menjadi 25% untuk mendapatkan waktu retensi amitriptyline sekitar 4 menit. Nitroaniline, ditambahkan untuk mengikat pengotor, memiliki waktu retensi ~ 1,6 menit dengan 70% MeCN. Ketika pH dinaikkan terhadap nilai pKa analit, waktu retensi meningkat tajam menjadi sekitar 12 menit dengan bentuk peak yang sangat luas (karena adanya analit yang bermuatan dan netral). Pada pH di atas nilai pKa, puncak peak menjadi sempit karena didominasi analit bermuatan.Waktu retensi pada pH 12 adalah 5,6 menit dan tidak bergeser jauh ketika pH 13 digunakan (data tidak ditampilkan). Selama percobaan waktu elusi dari unknown impurities (pengotor) diketahui tetap stabil pada retention time 2,4 menit.

Kesimpulan

Mengubah pH merupakan cara mudah, tetapi sering diabaikan untuk memanipulasi waktu retensi analit yang 'bermasalah'. Namun, penting untuk menghindari nilai pH sekitar nilai pKa analit karena bentuk peak menjadi sangat luas dan waktu retensi sangat berfluktuasi walaupun perubahan pH kecil.